Миниатюризиран CRISPR предлага мощен инструмент за редактиране на гени
Когато инструментът за редактиране на гени CRISPR-Cas9 стана известен преди повече от десетилетие, той трансформира биотехнологиите. По-бърз, по-евтин и по-безопасен от предишните методи, инструментът помогна на учените да придобият представа за функциите на гените.
CRISPR донесе потенциала да промени живота на хората, живеещи с наследствени заболявания. Благодарение на своята мощ за редактиране на гени, инструментът може да засили способността на имунитета да преследва ракови и други клетки. В края на 2023 г. FDA одобри терапия CRISPR за сърповидноклетъчна анемия и по-късно даде зелена светлина на хора с кръвно заболяване, наречено трансфузионно-зависима бета таласемия. Още терапии са в процес на разработка.
CRISPR има сериозен проблем. Системата е твърде голяма, което затруднява доставянето на генния редактор до клетките в мускулите, мозъка, сърцето и други тъкани.
Сега екип от Mammoth Biosciences има потенциално решение. Учените се стремят да намалят размера на оригиналната система CRISPR-Cas9. Новата им итерация, наречена NanoCas, минимизира размера на един ключов компонент, Cas9, до приблизително една трета от оригинала.
Това позволява инструментът да бъде опакован във вирус, който обикновено се използва за генна терапия в тялото. При мишки и маймуни екипът използва NanoCas за редактиране на гени, участващи в наследения висок холестерол и мускулна дистрофия.
Проблеми с доставката
CRISPR има два основни компонента. Единият е РНК молекула, която търси и свързва настройката към целева ДНК секция. Веднъж закачен, вторият компонент, Cas протеин, нарязва или отрязва генетичната лента.
През годините учените са открили или създали други версии на Cas протеини. Някои са насочени към РНК. Това е пратеника, който превежда гените в протеини. Други разменят отделни генетични букви, причинявайки наследствени заболявания. Някои дори набират ензими, за да модифицират системата, контролираща кои гени се включват или изключват.
Всички тези инструменти имат основен проблем. Те са трудни за доставяне в тялото поради техния размер. Сегашните CRISPR терапии разчитат главно на извличане на клетки и размяна на гените им. Редактираните клетки се вливат обратно в пациента. Наричани „ex vivo“ терапия, тези лечения се фокусират главно върху кръвни заболявания.
Коригирането на генетични проблеми в тялото с CRISPR добавя към сложността на терапията. Повечето методи се фокусират върху очите или черния дроб, които са относително лесни за достъп с инжекция. За всички останали тъкани е проблем.
За да транспортират редакторите до тъкани и клетки, терапиите трябва да бъдат опаковани във вирус или мастен мехур. Cas протеините могат да достигнат над хиляда аминокиселини на дължина, което вече подчертава капацитета на превозните средства за доставка. Добавете компонентите на направляващата РНК и системата надвишава ограниченията за багаж.
За да заобиколят ограниченията на теглото, учените са кодирали водещите РНК и Cas компоненти отделно в два вирусни носителя, така че и двата да могат да се промъкнат в клетките. Като алтернатива те са използвали мастни мехурчета, наречени липозоми, които капсулират и двата компонента за редактиране на гени.
Двойното натоварване с вирус увеличава риска от имунен отговор. Липозомите обикновено завършват в черния дроб и освобождават своя товар там. Това ги прави отлични в редактирането на гени в черния дроб. Важни цели като мозъка и мускулите са недостъпни.
Малък, но могъщ
Сега се търсят бази данни за по-малки Cas протеини. Тези бази данни съдържат различни проби от цялата планета, включително от микроби, събрани в блата, морска вода, черва и други източници. Екипът търси системи, които могат да редактират ефикасно, но изискват само малък водещ РНК компонент и съдържат под 600 аминокиселини.
От 22 000 метагенома екипът се фокусира върху 176 кандидата. Всеки от тях е проверен при опити в човешки бъбречни клетки. Така се търсят варианти на Cas, които работят добре в клетките на бозайниците, което е често срещано затруднение.
След още тестове учените се спряха на NanoCas. Той работи с приблизително 60% от ръководствата за РНК. Малкият редактор и неговата направляваща РНК са вписани във вирусен вектор. Като доказателство за концепцията, екипът създаде система NanoCas, насочена към PCSK9. Това е ген, свързан с опасно високи нива на холестерол, в черния дроб на мишки. Доставен с една инжекция във вените, малкият инструмент намалява гена до неоткриваеми нива в кръвта.
След това екипът се обърна към ген, наречен дистрофин в мускулите. Това е тъкан, до която традиционните методи на CRISPR достигат трудно. При мускулната дистрофия на Дюшен мутиралият дистрофин причинява прогресивна мускулна загуба. NanoCas редактира гена в голямо разнообразие от видовете мускули – бедрен, сърдечен и мускул на прасеца. Ефикасността варира от 10 до 40% от редактираните клетки.
След това екипът тества NanoCas при маймуни. След около два месеца приблизително 30% от техните скелетни мускулни клетки са редактирани успешно.
Рисковете
Генните терапии, използващи вируси, могат да натоварят черния дроб. По време на изпитването чернодробните функции на маймуните и други здравословни фактори остават относително нормални. Въпреки че системата редактира целеви гени при здрави маймуни, остава да се види дали може да лекува генетична загуба на мускули. Както при други системи за редактиране на гени, съществува и риск от неволно редактиране на нецелеви гени или стимулиране на имунна атака.
Въпреки това, миниатюрният NanoCas би могъл да прехвърли CRISPR до различни тъкани в тялото. Екипът вече проучва потенциала на системата за насочване към мозъчни заболявания. Технологията може също да бъде преработена за използване в епигенетично или основно редактиране.
